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      2. 细胞永生化

        正常细胞的生长代谢处于增殖、分化、衰老及凋亡的动态平衡。正常的哺乳动物细胞在体外的增殖是有限的,培养细胞生命的自然极限称为海夫利克极限(The Hayflick Limit)。一个正常的人类细胞在不能分裂之前只能复制和分裂4060次,并且会因细胞程序性死亡或凋亡而衰老死去。

        Jerry W. et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2000

         

        细胞永生化(Cell Immortalization)是指原代细胞在体外培养的过程中,由于自身基因变化或者外界各种刺激因素,逃脱了正常细胞的衰老死亡过程,获得了可以长期传代培养、无限分裂增殖特性的过程。


        永生化细胞具有增殖能力,并具有与亲本组织相似或相同的基因型和表型,能够提供稳定均一、性状一致的细胞来源,其意义主要包括但不限于:

        u  了解细胞生长规律,探索细胞衰老机制;

        u  体外研究细胞增殖、分化、凋亡等的理想模型;

        u  有助于明确致癌物质的作用机制;

        u  体内/外探究肿瘤发生机制的重要模型;

        u  为研究者提供更多且更丰富的细胞资源等。


        细胞永生化策略

        细胞永生化的机制主要包括:理化因素作用所致的原癌基因活化/抑癌基因失活;端粒酶的稳定活化;具有致瘤性的病毒如SV40病毒、EB病毒、人乳头状瘤病毒HPV等。

        一般而言,自发永生化的几率非常小,因此基于细胞永生化的机制,常通过转染技术人为地将外源性永生化基因导入目的细胞,或对抑癌基因进行敲除,或诱导永生化相关基因突变以增加永生化的发生率,从而建立稳定的永生化细胞株。

        病毒诱导:EBVHPV E6/7 SV40 T Antigen

               病毒基因如EBVHPV E6/7基因和SV40 T抗原可用于诱导永生化。在大多数情况下,病毒基因通过使诱导细胞进入复制衰老状态的肿瘤抑制基因(p53Rb)失活来实现永生化。其中SV40 T抗原已被证明是诱导多种类型细胞永生化的最简单和最可靠的材料。

        人端粒酶逆转录酶(hTERT)表达

               通过外源表达TERT也是一种细胞永生化的方法,特别是对受端粒长度影响较大的细胞。该蛋白在大多数体细胞中不活跃,但当hTERT外源表达时,细胞能够维持足够的端粒长度以避免复制衰老。

        肿瘤抑癌基因失活

               基于抑癌基因对细胞周期的控制和诱导细胞衰老的机制,经过对抑癌基因如肿瘤抑制基因p53、视网膜母细胞瘤基因Rb的敲除,使其失活可以让细胞进入无限增殖状态从而实现永生化。

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