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      2. CRISPR-Cas9基因编辑技术

        CRISPR-Cas 系统是原核生物的一种应对病毒(如噬菌体)入侵的免疫系统,其结构包括:规律成簇的间隔短回文重复序列CRISPRClustered regularly interspaced short palindromic repeats),前导序列LeaderCas基因序列Cas gene,以及反式激活CRISPR RNAtrans-activating CRISPR RNAtracrRNA 序列。该系统主要分为 Type Ⅰ、Type Ⅱ、Type 3种不同类型,其中Type Ⅱ系统只有一种核酸酶参与,即Cas9CRISPR-Cas9在细菌中起到的作用就是识别入侵的病毒,将其基因组片段录入自己的基因组,当病毒再次入侵时候,切割其DNARNA进而消除感染。

        Ran et al., Nat Protoc. 2014


        CRISPR-Cas9系统在编辑基因的时候,需要2个组成部分:Cas9核酸酶和sgRNAsingle guide RNA,引导RNA)。Cas9sgRNA会形成一个Cas9核糖核蛋白(ribonucleoproteinRNP)。这个RNP能结合到基因组上的靶序列上。基因组上的靶序列如果要被切割,需要满足两个条件:第一,sgRNA与基因组上有17-21个碱基的同源区,也被称为前间隔序列protospacer。第二,靶序列附近有前间隔序列邻近基序PAMprotospacer adjacent motif),需要注意的是,在设计sgRNA时,PAM并不是sgRNA的一部分。在满足上述两个条件后,在tracrRNA引导下,sgRNA与基因组上的靶序列结合,进而RNPPAM上游45个碱基的位置切割靶序列,形成一个DNA双链损伤。

        Ran et al., Nat Protoc. 2014

        在经过CRISPR-Cas9系统切割并产生DNA双链损伤(DSB)后,哺乳动物细胞会启动两种常见的DNA修复机制对断裂进行修复,即非同源末端连接机制NHEJ和同源定向修复机制HDR。利用NHEJ机制的易错性和HDR的同源重组特性,从而实现对靶基因的敲除、敲入、定点突变以及定点修复等目的。


        CRISPR-Cas9基因编辑技术现已风靡全球,没有哪种技术的普及与进展速度能与其比肩。2020年诺贝尔化学奖授予了法国女科学家埃玛纽埃勒·沙尔庞捷和美国女科学家珍妮弗·杜德纳,以表彰她们在基因组编辑方法研究领域做出的贡献。CRISPR-Cas9基因编辑技术的应用包括但不限于:


        u  用于基因敲除(沉默)或敲入(点突变、标签等);


        u  通过单碱基突变等用于基因修复(如白内障);


        u  阻止靶基因mRNA转录以进行基因表达调控;


        u  适合构建抗性基因文库,进行大规模文库筛选;


        u  在活细胞中监测染色体的构象变化或基因分布等。


        CRISPR-Cas9基因编辑技术的优缺点


        现在国内外高校科研机构及商业市场对CRISPR-Cas9基因编辑技术的开发、改进和应用仍处在上升期,该技术本身虽已相对成熟并在生物医药领域突显了优势,但仍然有其亟待解决的缺陷。CRISPR-Cas9基因编辑技术的优缺点主要体现在以下几个方面:

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